细胞凋亡简介

Sabine Kirchhoff, Andreas Krueger, and Peter H, Krammer

导言

　　Apoptosis，细胞凋亡，又称细胞程序性死亡，近年来得到研究者的极大关注。2001 年约有10000 篇关于凋亡的研究文章发表。19 世纪中期C. Vogt 首先描述了两栖动物变态过程中细胞死亡的形态学现象¹。这种现象在本世纪后半叶被Kerr、Wyllie 和Currie（1972）重新发现，并创造了apoptosis 一词，细胞凋亡的研究进展吸引了科学界的注意²。即使不是该领域专家的人们都了解了，手指和脚趾不是直接由胚胎的手或脚原基分化而来，而是经历了指/趾间细胞的死亡、凋亡，这种过程已经由基因敲除小鼠验证。其它许多此类现象说明凋亡在发育过程中发挥关键作用^3-6 。目前，我们已经认识到细胞凋亡参与多种生理过程，绝大多数疾病的发病机理都与细胞凋亡有关（过多或过少），如AIDS、癌症以及自体免疫疾病⁷。可以说，细胞凋亡是生命不可分割的一部分。

　　死亡有多种类型。除了组织因受伤坏死的情况，发现了几种不同类型的细胞凋亡。多数研究者认为细胞凋亡导致的死亡通常伴随着细胞膜倒转，磷脂酰丝氨酸残基外翻，胞膜出泡，核小体片段，染色质浓缩以及DNA 降解。

　　基本的凋亡信号通路和其中涉及的蛋白在进化上高度保守。对线虫C. elegans 的遗传筛选发现了三个代表基本凋亡机制的基因ced-9，ced-4，ced-3 ，这种机制在哺乳动物系统中也是保守的⁸。CED-9 为抗凋亡分子，对前凋亡分子CED-4 起负调控作用，而CED-4 激活Cys 蛋白酶CED-3 。在哺乳动物中，已经发现了对应于CED-9 、CED-4 和CED-3 的同源分子：Bcl-2 、Apaf-1 和Caspase 蛋白酶家族。EGL-1 ，前凋亡“BH3－domain only”Bcl-2 家族成员的同源分子（这个家族包括如Bik、Bid 和Bad），是C.elegans 线虫的另一种与CED-9 作用的前凋亡分子，抑制CED-9 抗凋亡活性从而启动CED-4/CED-3 凋亡机制。

　　与线虫相似，哺乳动物中同样含有一个基本的凋亡机制。但是在哺乳动物细胞中，线粒体通常起多种形式凋亡过程的中心检验点作用（参见综述11）。在果蝇中也逐步发现了与线虫和哺乳动物同源的基本凋亡机制涉及的蛋白，如Apaf-1/Ced-4 的对应分子HAC-1，Dapaf-1 和Dark^12-15 。凋亡可被多种刺激因素启动，如生长因子的停止供应（“被忽视而死亡”），紫外线或γ射线照射，化学治疗药剂以及“死亡受体”在细胞表面的表达。近来对死亡受体引发的凋亡领域的研究很受重视。所以本综述集中于受体介导的凋亡途径，尤其是CD95 通路。

死亡受体和死亡配体

　　发现能特异性诱发凋亡的系列受体是凋亡研究的一大突破。死亡受体家族的成员不断增加，这些成员属于TNF /NGF-受体超家族，都具有富半胱氨酸的膜外结构域。死亡受体具有一个胞内的死亡结构域（Death Domain，DD），通过这个结构域将受体与凋亡诱导途径耦连起来。此家族包括：CD95(APO-1/FAS), TNF-R1(CD120a), DR3 (APO-3, LARD, TRAMP, WSL1), TRAIL-R1(APO-2, DR4), TRAIL-R2(DR5, KILLER, TRICK2) 以及DR6(Fig. 1)¹⁶。在这些受体中，CD95 是目前研究得最为清楚的死亡受体⁷。

　　除了受体，很容易推断配体的结构也有很大的同源性，反应在受体识别和触发的相似机制上。死亡配体作为一个死亡配体家族－TNF 家族，与死亡受体共同演化。除了LTa，死亡配体以Ⅱ型跨膜蛋白的形式合成，并可由金属蛋白酶作用产生一个可溶形式。可溶的CD95L 的功能目前并不太清楚。一些研究人员认为这类配基的膜结合形式诱导凋亡，一些人认为是由可溶形式诱导。

死亡受体信号转导

　　体内死亡受体的激活常受各自死亡配体的控制，这些可诱导、可重新表达的死亡配体如CD95L、TNF、TRAIL。CD95 由竞争性抗体或CD95L 启动，形成三聚体。近来提出死亡受体在激活之前通过其“Preligand Binding assembly domains”(PLAD)进行组装^19，20。在这种情况下，可能通过预先形成的死亡受体三聚体的构象变化诱导信号的产生，或由配基结合形成多聚复合物从而诱导信号产生。在死亡受体信号转导研究方面最大的进展是发现了死亡受体的DD 结构。作为某些蛋白的一部分，DD 被发现可以自联、并与其他蛋白中的DD 结构结合。DD 之间的这种结合作用是受体－配基结合的产物。自联之后，受体的DD 结构域恢复，并与其他含有DD 结构域的蛋白结合，从而在信号传导的级联反应中起到适配器的作用。第一个确认的CD95 adapter 蛋白为FADD/Mort-1^21，22。除了DD 结构域，FADD/Mort-1 在其N 末端还含有一个死亡作用因子结构域death effector domain（DED）²³。采用传统生化方法发现了更下游的一个与FADD 的DED 结合、含有DED 结构域的蛋白²⁴。此蛋白的C 端含有一个典型的ICE-like 蛋白酶结构域，从而被称为FLICE（FADD-like ICE ）。FLICE 也被其他两个研究小组克隆出来并命名为MACH、Mch5^25，26。它是Cys/Asp 蛋白酶，属于caspase 家族，现在被归类为procaspase-8²⁷。Procaspase-8（FLICE 、MACH、Mch5）^24，25 ， CAP3²⁸，一个目前尚未确认的分子，以及pro-caspase-10^29,30，向低聚CD95 聚集，形成一个凋亡诱导信号分子复合物（DISC）²⁸。根据诱导－聚集模式，Pro-caspase-8 被DISC 自身水解^31，32。最近发现，细胞胞浆中总的pro-caspase-8 分子可以在DISC 作用下转化为有活性的caspase-8 亚单位³³，从而形成有活性的caspase-8 异四聚体，凋亡信号初始化。现设想这种活性四聚体可以切割多种死亡底物，包括其它的caspases 如caspase-3 ，从而导致凋亡过程的执行。CD95 信号传导的一个近似的模型被提出，包括：1. CD95 微聚集体的形成；2. DISC形成；3. 大的CD95 表面簇形成；4. 活化的CD95 的内化³⁴。

　　与CD95 相反，TNF-R1 的信号通路似乎复杂得多。RAIDD/CRADD 为另一种含DD 结构域的蛋白，在体外与TNF-R1 结合或在293 细胞中过量表达是时与TNF-R1 结合^35，36。RAIDD/CRADD 在C 端携带DD 结构域，其N 端显示与caspase-2 prodomain 的同源性。在RIP 存在情况下，能更有效地与TNF-R1 结合。RAIDD 可能通过RIP 与TNF-R1 结合，诱导caspase-2 的活化。RIP 通过TRADD 聚集，与TRAF2 相似。最后导致NF-kB 激活，而NF-kB 诱导炎症反应和抗凋亡基因³⁷。TRAIL-R1(DR4, APO-2) ，以及TRAIL-R2(DR5) 被发现是结合TRAIL 的受体。这两种TRAIL 的受体功能与CD95 相近，他们的主要作用都是诱导凋亡产生^38-43 。近来发现FADD、caspase-8 以及caspase-10 也会向TRAIL-R1 和TRAIL-R2 聚拢，FADD 和caspase-8 是通过TRAIL-R2 途径诱导凋亡所必需的^{29，30，44-46} 。

不同的CD95 信号通路

　　比较不同细胞株中使用抗CD95 抗体触发的信号通路，发现两种细胞型⁴⁷ ，命名为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅱ型通路涉及线粒体通路的激活，线粒体途径已被发现在多种形式凋亡中起重要作用^48，49。此模型可能可以解释关于CD95 系统的多种有争议的报告。体外对人类原代T 细胞的研究^50，51 和体内小鼠基因敲除的研究^{3，5，6，52，53} 支持这种模型。Ⅱ型细胞利用线粒体作为“放大器”以启动凋亡的caspase 级联反应。线粒体的激活由pro-apoptotic BH3-only Bcl-2 家族成员Bid 介导。Bid 为caspase-8 底物，后者由Ⅱ型细胞中低含量的DISC 激活。截断的Bid（tBid）转移至线粒体，在此转移过程中，tBid 诱导pro-apoptotic Bcl 家族成员Bax 和Bak^54，55 的低聚作用，从而丧失ΔΨm，释放出apoptogenic 因子如细胞色素C，凋亡诱导因子AIF，核酸内切酶G 或caspase 的二级线粒体衍生激活因子(Smac/DIABLO)^56-64 。在细胞质中，细胞色素C 与Apaf1 结合，随即罗致caspase-9 形成apoptosome 9 复合物⁶⁵。在apoptosome 中，pro-caspase-9 被激活，从而启动caspase 级联反应下游的线粒体^66，67。故Ⅱ型细胞中，CD95 介导的凋亡依赖于线粒体激活，而Ⅰ型细胞则不依赖于线粒体激活。

FLIPs(FLICE-Inhibitory Proteins)

　　Caspase－8 被发现后不久，发现了同源的缺乏caspase活性的病毒蛋白。其中一些蛋白为γ－herpes 病毒的组成成分，如herpes virus Saimiri(HVS), 人herpes virus 8(HHV8), Kaposi 瘤相关疱疹病毒, 以及Moluscum contagiosum virus。这些蛋白被称为v-FLIPs 。v-FLIPs 由两个DED 组成。这两个DED 结构与CD95 DISC 结合，从而抑制caspase-8 的激活⁶⁸。v-FLIPs 可以抑制多种死亡受体诱导的凋亡，包括CD95, TNF-R1, DR3, DR4, 意味着这些受体可能有相似的信号通路⁶⁹。发现病毒FLIPs 后，几个实验室分别发现了细胞中的同源近似物，称为：c-FLIP/FLAME1/l-FLICE/Casper/CASH/MRIT/CLARP/Usurpin⁷⁰。c-FLIP 具两种形式，短型和长型。短型结构与v-FLIP 近似，长型具有与caspase-8 相近的结构域，同时含有一个无火星的酶结构域，在受体水平上干扰活性caspase-8 的产生，在Ⅰ型和Ⅱ型细胞中都存在^51，71。除CD95 介导的凋亡以外，发现c-FLIP 在黑色素瘤细胞和原代人类角化细胞中的表达与细胞抵抗TRAIL-诱导的凋亡的能力有关^72，73。另外发现c-FLIP 的异常表达与自身免疫性有关⁷⁴。c-FLIP 在特定情况下也可作为肿瘤发展因子起作用^75，76。c-FLIP 和c-FLIPs 的短剪接体由CD3 再激活、CD28 共激活T 细胞，从而可能对T 细胞的表型起作用^77，78。与死亡受体介导的凋亡相反，γ射线、化学药剂、perforin/granzyme B 诱导的细胞死亡则不受c-FLIP 抑制⁷⁹。c-FLIP 的两种剪接突变体的生物学差异是目前研究的重点。

临床上的意义

　　细胞凋亡使人类对多种疾病的致病机理的了解翻开了新的篇章。一般来说，太少凋亡或太多都会导致疾病。例如，自身免疫性淋巴增生综合症(ALPS) 被发现具有CD95 突变(Type 1a)、CD95L 突变(Type 1b)、caspase-10(TypeⅡ)，这些突变影响了经凋亡除去T 淋巴细胞的过程⁸⁰。另外，癌症可以被看作是细胞凋亡异常少的疾病，肿瘤负担的净增长是不断增加的生长速率与减少的凋亡速率的结果。与之相反，AIDS 则表现为过多的淋巴、非淋巴细胞凋亡，尤其是CD4 阳性T 细胞。因此对细胞凋亡信号转导分子机制的阐明有助于未来恢复病人的正常凋亡水平。