细胞凋亡的诱导

　　p53、p21^WAF1、Myc、Bcl-2 、Bax 及Bak 等蛋白参与细胞凋亡的调节。下表列出了可诱导凋亡的试剂。不是所有诱导剂都可诱导每种类型细胞产生凋亡。地塞米松实际上可以刺激某些类型细胞生长。依赖于所选诱导剂和使用的浓度，一种特定蛋白的最大诱导效果可能于诱导处理8-72 小时后出现。我们发现针对一种特定细胞系，下列的诱导剂并未能影响所有的这些凋亡调节蛋白。即使是参与阻止凋亡的蛋白，如Bcl-2 ，在经过这些处理后也可能诱导凋亡 (但时间周期不同)。

凋亡诱导剂

DNA 损伤诱导的凋亡―――48 小时操作流程

　　以下凋亡诱导操作基于细胞对于化学试剂如Doxorubicin、5-Fluorouracil 、Paclitaxel、Vinblastine 等导致的DNA 损伤所产生的p53 依赖的G1-arrest 。p53 和p21^WAF1 诱导的一个典型时间周期为40-48 小时，采用一种DNA 损伤试剂进行处理。其它参与凋亡的相关蛋白也被诱导(在一种特定细胞类型中，使用一种凋亡诱导剂并不能诱导产生所有凋亡相关蛋白)。我们建议监测几个时间点(如24、48 和72 小时)。要使p21^WAF1 达到最大诱导效果需要野生型p53 的活力。若无野生型p53，p21^WAF1 也可经血清刺激的G1-arrest 细胞或如dexamethasone 之类的试剂诱导产生，尽管这样产生的p21^WAF1 的水平远低于通过p53－依赖型诱导产生的p21^WAF1 水平。

　　第一天：按最多1×10⁶ 粘附细胞接种于2 或10cm 组织培养皿，非粘附细胞接种于T-75 培养瓶。另接种一瓶作为阴性对照或基本表达水平对照；第二天：确定细胞正在生长。细胞达到一定终浓度时加入DNA 损伤试剂，未诱导对照中加入相应体积的缓冲液或溶剂（如DMSO）；第三天：检查确定细胞是否开始死亡。若有超过75％细胞死亡，收集细胞。第四天：收获细胞，制备溶菌液，按相应操作手册进行Western Blotting 或免疫沉淀。无论使用何种诱导剂，都可通过接种额外的培养皿或培养瓶，在加入DNA 损害剂的不同时间段收获已了解诱导进程。为检测凋亡蛋白，死亡细胞也需收集。第五天：以SDS-PAGE 电泳分离蛋白。可以通过Western blotting 化学发光法检测总裂解物中感兴趣的目的蛋白，按照相应操作手册进行。

　　始终注意比较处理细胞和未经处理的对照细胞中p53 和p21WAF1 的水平差异，以确定诱导效果。对于γ射线诱导p53 和p21WAF1 的情况，请参考El-Deiry, W. S., et al. 1994. Cancer Res. 54, 1169 以及Deng, C., et al. 1995, Cell 82, 675。