凋亡与凋亡检测试剂盒

　　细胞凋亡过程中可观察到系列形态学特征和生化特征。早期凋亡信号的效应产生于胞内，此时细胞膜保持完整。MERCK 公司已发展出几种方法以检测凋亡细胞胞内的多种效应，包括：DNA 片段的检测、膜对称性的变化、caspases 激活、以及细胞死亡相关蛋白水平的变化等。多数检测使用的底物和Marker 适用于绝大多数种类的哺乳动物。

　　凋亡细胞染色体DNA 以核小体为单位的切割导致细胞不可逆死亡。可以采用Nucleosome ELISA(货号：QIA25)，对产生的单体及寡聚核DNA 片段进行定量。核小体的DNA 成分被捕获于酶标板上，使用生物素标记的抗组蛋白抗体检测捕获的核小体数量。组蛋白-DNA 片段的量反应了一个特定样品中死亡及濒临死亡的细胞的量。

　　DNA 片段也可通过片段末端标记进行原位检测，MERCK 提供基于TUNEL 方法的试剂盒FragEL^TM DNA Fragmentation Detection Kits (使用 TdT 的，货号QIA33、QIA39；使用Klenow 的，货号QIA21)。适用于多种动物来源样本（石蜡、冰冻或固定细胞）。DNA 片段末端标记可通过荧光染料（QIA39）或比色底物（QIA21、QIA33）方法进行检测。另外，细胞形态的变化如胞膜皱摺或出泡、核染色质致密、胞质浓缩等，都可作为细胞凋亡的证据。采用荧光染料进行末端标记的可用流式细胞技术进行定量，其光散射变化也可支持由单一参数得出的结论。DNA 片段可以从凋亡细胞中分离(Suicide Track^TM DNA ladder Isolation Kit, 货号AM41)并使用琼脂糖电泳进行分析。约180bp 的多倍寡核小体片段在电泳上呈典型的梯状条带，可进一步证实凋亡的存在。若使用Pellet Paint Co-Precipitant( 货号69049)，只需室温操作，两分钟即帮助DNA 沉淀更快捷方便。

　　线粒体膜电位和膜通透性的变化也是凋亡细胞一个重要特点。可使用Cytochrome c ELISA Kit(QIA74)或Cytochrome c Release Apoptosis Assay Kit(QIA87)试剂盒检测凋亡细胞线粒体所释放的细胞色素C。也可使用Cytosol/Mitochondria Fractionation Kit(QIA88)分离凋亡细胞线粒体，其膜电位可通过MitoCapture^TM Apoptosis Detection Kit(475866)检测。凋亡细胞另一个生化特征是细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸从胞质转至胞外。膜联蛋白中的Annexin Ⅴ，是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有强亲和力。通过使用Annexin Ⅴ-FITC(PF032) 或Annexin Ⅴ-Biotin(PF036) Apoptosis Detection Kit ，及RAPID^TM 方法进行凋亡细胞早期检测。可使用流式细胞仪或荧光显微镜监测。同时使用PI，根据细胞膜的通透性区分早期凋亡细胞和坏死细胞。

　　凋亡过程中细胞核同样发生了结构变化。接收到凋亡信号后，核基质蛋白(NMPs)释放。NMP 的释放与细胞死亡相联系，MERCK 的Cell Death Detection(NMP) ELISA(QIA20) 可定量检测细胞培养上清中的NMP 水平变化。此种检测方法优于其它方法的原因在于可以直接检测组织培养基中NMPs 的水平，而不需细胞总裂解物，从而避免了细胞计数和样品准备等操作。除了结构变化，凋亡细胞谷胱甘肽水平会降低，可通过Glutathione Apoptosis Assay Kit(QIA89)进行检测。

　　凋亡可被系列环境危害、发育信号等诱导产生，免疫耐受的诱导和保持，涉及细胞表面受体的参与。Fas(APO-1, CD95) 是主要的死亡受体，在多种细胞中引发凋亡过程。Fas 配体（FasL/CD95L）与Fas 结合，激活的Fas 进而激活包含caspase 在内的几种效应蛋白。FAS/APO-1 ELISA Kit(QIA24)可以检测细胞抽提物、组织培养物、血清中Fas 的水平。同样，Fas Ligand ELISA (QIA27)可定量检测上述各种形式样品中的膜结合FasL 和可溶性FasL。两种检测试剂盒都具有很好的灵敏度和精确度。另外两种ELISA 试剂盒都提供96 孔板形式，适于高通量筛选。

　　Caspases 参与Fas 介导的细胞凋亡的情况现已阐明。Caspase-8 和caspase-9 启动效应因子caspase-3 ，后者切割细胞内含有特定识别序列的底物。针对caspases 的活性检测，通过对特定底物的切割、释放出荧光产物。同时提供阳性对照、阴性对照、特异的caspase 抑制剂以辅助解释实验结果。另外caspase-3 、caspase-8 和caspase-9 活性检测试剂盒都提供高通量形式帮助筛选鉴定触发细胞凋亡信号的因子。

　　现已发现几种抑制凋亡的蛋白。Bcl-2 家族是此领域现在了解最多的一系列蛋白。Bcl-2 的切割和失活可用Bcl-2 ELISA(QIA23) 监测。已发现凋亡过程中Bcl-2 水平降低，DNA 降解片段、Annexin Ⅴ的结合、NMP 水平增加等。为彻底了解细胞凋亡，一个具体实验可能需要联合应用以上述及的几种检测手段以确定凋亡进程。

MERCK 凋亡检测试剂盒一览

1、FragEL DNA Fragmentation Detection Kit

------Colorimetric, Klenow Enzyme

　　目录号：QIA21 　　包装：50T/Kit

　　该试剂盒可用于所有动物组织的冰冻和石蜡切片或培养细胞的凋亡细胞的检测，试剂盒中提供：蛋白酶K、Klenow 酶及反应Buffer、终止液、封闭液、Streptavidin-HRP 、DAB、甲基绿、H2O2/Urea、阴性及阳性对照片

2、FragEL DNA Fragmentation Detection Kit

------Colorimetric, TdT Enzyme

　　目录号：QIA33 　　包装：50T/Kit

　　该试剂盒可用于所有动物组织的冰冻和石蜡切片或培养细胞的凋亡细胞的检测，试剂盒中提供：蛋白酶K、TdT 酶及反应Buffer、终止液、封闭液、Streptavidin-HRP 、DAB、甲基绿、H2O2/Urea、阴性及阳性对照片

3、FragEL DNA Fragmentation Detection Kit

------Fluorescent, TdT Enzyme

　　目录号：QIA39 　　包装：50T/Kit

　　该试剂盒可用于所有动物组织的冰冻和石蜡切片或培养细胞的凋亡细胞的荧光检测，试剂盒中提供：蛋白酶K、TdT 酶、平衡缓冲液、荧光标记反应混合物、防荧光淬灭剂、阴性及阳性对照片

4、Suicide Track DNA Ladder Isolation Kit

　　目录号：AM41 　　包装：25T/Kit

　　为您提供简便可靠的凋亡细胞DNA 片断分离试剂盒，经国内很多用户验证效果上佳！试剂盒中提供：裂解液、抽提液、RNase、DNA 分离液、共沉淀试剂、上样缓冲液、再悬浮缓冲液、DNA Markers 及DNA Ladder 对照。

5、Annexin V Apoptosis Detection Kit, FITC

　　目录号：PF032 　　 包装：100T/Kit

　　本试剂盒特有的RAPID Media Binding Reagent 可直接将Annexin V-FITC 标记于培养液中的细胞上，实验结果可用流式细胞仪或荧光显微镜检测。可用于多种种属来源细胞的检测。试剂盒中提供：Annexin-FITC 、Binding Buffer、碘化丙啶、RAPID Media Binding Reagent 等。

6、 Annexin V Apoptosis Detection Kit, Biotin

　　目录号：PF036 　　包装：100T/Kit

　　本试剂盒特有的RAPID Media Binding Reagent 可直接将Annexin V-FITC 标记于培养液中的细胞上，实验结果可用流式细胞仪或荧光显微镜检测。可用于多种种属来源细胞的检测。试剂盒中提供：Annexin-Biotin 、Binding Buffer、碘化丙啶、RAPID Media Binding Reagent 等。购买此试剂盒需另自配Streptavidin-FITC 或Streptavidin-PE 或链亲和素连接的其他荧光物质。

7、Nucleosome ELISA Kit

　　目录号：QIA25 　　包装：96wells

　　该试剂盒可用于任何种属来源的细胞裂解液中核小体的定量检测。灵敏度：0.15unit/ml ( 单位定义：The amount of nucleosomes from 444 UV-treated Daudi cells) ，线性范围：0-12units/ml，试剂盒中提供：已包被的可拆96 孔板、核小体标准品、裂解缓冲液/样本稀释液、生物素标记的抗组蛋白3 抗体、Streptavidin-HRP 、底物、洗板液、终止液等。

8、Cell Death Detection (Nuclear Matrix Protein) ELISA Kit

　　目录号：QIA20 　　包装：96wells

　　本试剂盒可用于人细胞培养上清中NMP 的检测。高灵敏度：10unit/ml，线性范围：0-600units/ml，单位定义：每单位NMP 的量相当于1-5*10⁵ 850 MCF7 细胞在无血清培养基中培养七天后所释放出的NMP 的量。试剂盒中包括：已包被的96 孔板、冻干的NMP 标准品、生物素标记的抗人NMP 抗体、HRP 标记的Streptavidin，底物、洗板液、终止液等。

9、Cytochrome c Release Apoptosis Assay Kit

　　目录号：QIA87 　　 包装：100T/Kit

　　本试剂盒用Western Blotting 方法检测细胞色素C 从线粒体向细胞质中的释放情况而判断细胞凋亡。试剂盒中提供：线粒体抽提缓冲液、细胞质抽提缓冲液、蛋白酶抑制剂混合物、还原剂、细胞色素C 抗体等。

10 、Cytochrome c ELISA Kit

　　目录号：QIA74 　　 包装：96wells

　　本试剂盒可用于人的细胞裂解液中细胞色素C 的定量检测。灵敏度：70pg/ml，线性范围：0.07-5ng/ml 。试剂盒中提供：已包被的96 孔板、标准品、稀释液、裂解缓冲液、洗板液、Conjugate、染色底物A＆B、终止液等。

11、MitoCapture Apoptosis Detection Kit

　　目录号：475866 　　包装：100T/Kit

　　本试剂盒提供了一种基于荧光方法的区分正常细胞和凋亡细胞的简便方法。其基本原理如下：MitoCapture 为一种离子型染料，在正常细胞中，MitoCapture 可在线粒体中积累并聚合，其聚合体发红色荧光；在凋亡细胞中，由于线粒体膜电位的改变， MitoCapture 不能在线粒体中积累并以单体形式存在于胞浆中，其单体发绿色荧光；由此可以非常简单地通过荧光显微镜来区分正常细胞和凋亡细胞，也可以用流式细胞仪进行定量检测。整个检测可以在40 分钟内完成。试剂盒中提供：MitoCapture 试剂、孵育缓冲液等。

12、Glutathione Apoptosis Assay Kit, 荧光法

　　目录号：QIA89 　　　包装：100T/Kit

　　MCB (Monochlorobimane)是一种荧光染料，在GST 的作用下，它可以与谷胱甘肽结合并会发出蓝色荧光（激发波长：380nm，发射波长：461nm）。本试剂盒利用MCB 的这一特性检测凋亡过程中谷胱甘肽的水平。试剂盒包括：细胞裂解液，MCB，GST 试剂

四、细胞凋亡相关因子的检测 (WAF1, p53, Bcl-2, Fas/APO-1, Fas Ligand)

1、p53 ELISA Kit

　　MERCK 为您提供四种p53 相关的高质量ELISA Kit：突变型p53 特异性的ELISA Kit、总p53 的ELISA Kit、总p53 的快速测定ELISAKit 和p53 自身抗体的ELISA Kit：

a、突变型p53 ELISA Kit

　　目录号：QIA03 　　包装：96wells

　　该试剂盒可用于人及小鼠突变型p53 的定量检测，与未失活的野生型p53 也有交叉反应，灵敏度：250pg/ml，线性范围：250-4000pg/ml ，样本：A-431 细胞或其他细胞株，组织抽提物或细胞质，操作时间：过夜。试剂盒提供：已经包被的可拆卸96 孔板、冻干的突变型p53 标准品、样本稀释液、检测抗体、HRP 标记的二抗、显色底物、洗板液、分析用缓冲液等。

b、总p53 ELISA Kit

　　目录号：QIA07 　　包装：96wells

　　该试剂盒可用于人的野生型及突变型p53 的定量检测，灵敏度：10pg/ml，线性范围：250-4000pg/ml ，检测样本：细胞抽提物、组织抽提物、细胞培养液及血清，操作时间：过夜。试剂盒提供：已经包被的可拆卸96 孔板、冻干的重组人p53 标准品、样本稀释液、抗原抽提试剂、检测抗体、HRP 标记的二抗、正常小鼠血清、显色底物、洗板液、反应终止液等。

c、总p53 快速测定ELISA Kit

　　目录号：QIA26 　　包装：96wells

　　该试剂盒可用于人的p53 的快速定量检测，灵敏度：12pg/ml，线性范围：0-2000pg/ml ，检测样本：细胞抽提物、细胞培养液，操作时间：5 小时。试剂盒提供：已经包被的可拆卸96 孔酶标板、冻干的人p53 标准品、样本稀释液、抗原抽提试剂、生物素标记的抗p53 检测抗体、HRP 标记Streptavidin、显色底物、洗板液、反应终止液等。由于PMSF 极不稳定，需自备蛋白酶抑制剂混合溶液：含有5mM EDTA、0.2mM PMSF、1ug/ml Pepstatin、0.5ug/ml Leupeptin 的pH7.4 的50mM Tris 溶液。

d、p53 自身抗体ELISA Kit

　　目录号：QIA53 　　包装：96wells

　　该试剂盒可用于人血清中p53 自身抗体的定量检测，线性范围：0.16-1 抗体滴度单位，操作时间：2.5 小时。试剂盒提供：已经包被的可拆卸96 孔板、标准品 (人血清)、阴性对照、样本稀释液、HRP 标记抗人抗体、显色底物、洗板液、反应终止液等。

2、WAF1 (p21^WAF) ELISA Kit

　　目录号：QIA18 　　包装：96wells

　　本试剂盒可用于人细胞裂解液、细胞培养上清中WAF1 的检测。高灵敏度：0.1unit/ml，线性范围：0.1-20units/ml ，单位定义：每单位WAF1 相当于2.7*10⁵ 个细胞中WAF1 的活性。提供实验所需的全部缓冲液，试剂盒中包括：已包被的可拆卸96 孔板、抗原抽提试剂、冻干的WAF1 标准品、样本稀释液、FITC 标记的抗人Bcl-2 抗体、HRP 标记的Anti-FITC 抗体，底物、洗板液、终止液等。由于PMSF 极不稳定，需自备蛋白酶抑制剂混合溶液：含有5mM EDTA、0.2mM PMSF 、1ug/ml Pepstatin、0.5ug/ml Leupeptin 的pH7.4 的50mM Tris 溶液。

3、Bcl-2 ELISA Kit

　　目录号：QIA23 　　包装：96wells

　　本试剂盒可用于人细胞裂解液、细胞培养上清、血清和血浆中Bcl-2 的检测。高灵敏度：1unit/ml，线性范围：0-200units/ml ，单位定义：每单位Bcl-2 相当于5.6*10⁴ 个HL-60 细胞中Bcl-2 的活性。提供实验所需的全部缓冲液，试剂盒中包括：已包被的96 孔板、抗原抽提试剂、冻干的Bcl-2 标准品、样本稀释液、FITC 标记的抗人Bcl-2 抗体、HRP 标记的Anti-FITC 抗体，底物、洗板液、终止液等。由于PMSF 极不稳定，需自备蛋白酶抑制剂混合溶液：含有5mM EDTA、0.2mM PMSF、1ug/ml Pepstatin、0.5ug/ml Leupeptin 的pH7.4 的50mM Tris 溶液。

4、Fas/APO-1 ELISA Kit

　　目录号：QIA24 　　包装：96wells

　　本试剂盒可用于人细胞裂解液、细胞培养上清、血清和血浆中可溶的和结合的Fas 的检测。高灵敏度：0.05unit/ml，线性范围：0-10units/ml ，单位定义：每单位Fas 相当于1*10⁴ 个HUT78 细胞中Fas 的活性。试剂盒中提供实验所需的全部缓冲液，试剂盒中包括：已包被的96 孔板、抗原抽提试剂、冻干的Fas/APO-1 标准品、样本稀释液、生物素标记的抗人Fas 抗体、HRP 标记的Streptavidin，底物、洗板液、终止液等。由于PMSF 不稳定，需自备蛋白酶抑制剂混合溶液：含有5mM EDTA、0.2mMPMSF、1ug/ml Pepstatin、0.5ug/ml Leupeptin 的pH7.4 的50mM Tris 溶液。

5、Fas Ligand ELISA Kit

　　目录号：QIA27 　　包装：96wells

　　本试剂盒可用于人细胞裂解液、细胞培养上清、血清和血浆中可溶的和结合的Fas Ligand 的检测。高灵敏度：20pg/ml，线性范围：0-325pg/ml 。试剂盒中包括：已包被的96 孔板、抗原抽提试剂、冻干的Fas Ligand 标准品、样本稀释液、生物素标记的抗人Fas Ligand 抗体、HRP 标记的Streptavidin ，底物、洗板液、终止液等。由于PMSF 不稳定，需自备蛋白酶抑制剂混合溶液：含有5mM EDTA、0.2mM PMSF、1ug/mlPepstatin、0.5ug/ml Leupeptin 的pH7.4 的50mM Tris 溶液。