Caspase 活性检测

(比色法&荧光法)

一、比色法检测Caspases 活性（基于pNA 标记底物的比色法）

　　比色法的caspase 底物可通过检测凋亡细胞中caspases 活性衡量诱导剂效果，或用于筛选caspases 的激活剂或抑制剂。

　　本操作步骤主要针对使用酶标仪进行读数而设计。其中使用的细胞抽提物、底物、抑制剂及pNA 的用量为每个样本140ul。若您希望设计针对分光光度计读数的实验，建议对每种溶液体积进行进一步优化。

所需溶液、试剂及设备

• Caspase 底物
• Caspase 抑制剂
• 细胞裂解缓冲液：50mM HEPES, pH7.4, 100mM NaCl, 0.1%CHAPS, 1mM DTT, 100uM EDTA
• 检测缓冲液：50mM HEPES, pH7.4, 100mM NaCl, 0.1%CHAPS, 10mM DTT, 100uM EDTA, 10%Glycerol
• PBS：将8g NaCl、200mg KCl 和1.44g Na2HPO4 溶于800ml 蒸馏水；用HCl 调至pH7.4；定容至1L
• 酶标板和酶标仪

其它试剂(推荐)

• 纯化的Caspase
• pNA

细胞抽提物的制备

　　以适合的凋亡诱导剂对细胞进行诱导(参考前述操作方法)，同时做阴性对照，包括未处理细胞、用诱导剂的无诱导活性类似物处理细胞(若可得到)，或一个凋亡诱导处理“零时间”样品。应保证有足够细胞进行重复实验，包含或不含抑制剂的对照以检测蛋白浓度。一般来说，我们下面推荐的裂解前细胞数量可以产生足够蛋白浓度供酶标仪检测；然而不同大小、体积的细胞及蛋白浓度可能需要增加酶标板plating densities。当裂解2×10⁷/ml 细胞是，产生的蛋白浓度约为1-3mg/ml，体积10ul，含约10-30ug 蛋白。依据其细胞系，最少应有10⁶ 个细胞，体积50ul 的裂解缓冲液进行处理。

• 细胞计数，离心富集细胞。以PBS 缓冲液洗涤一次。若细胞已被caspase 抑制剂处理过，建议多洗几次以防止后继实验中可能造成的不利影响；
• 以预冷裂解缓冲液将细胞重新悬浮至期望浓度，冰浴5 分钟；
• 4℃，10,000×g ，离心10 分钟；
• 收集上清（胞浆抽提物），置于冰上备用。也可将抽提物以冰丙酮/乙醇速冻后储存于-70℃备用。

活性分析

准备caspase 底物和抑制剂的贮存液。

1. 制备浓度为100mM 的底物的DMSO 贮存液。取储液以检测缓冲液按1:50（2mM）稀释。分装剩余底物储液，冻存于-20℃；

2. 制备浓度为100mM 的抑制剂的DMSO 贮存液。取储液以检测缓冲液按1:1000 (100uM) 稀释，再取5ul 此稀释液加入950ul 检测缓冲液中获得5×工作浓度（500nM）。分装剩余储液，冻存于-20℃；

3. 将适量检测缓冲液加入酶标板的每个孔中。空白及细胞抽提样品为确定细胞活性所必需。为测量caspase 底物的非特异性水解，建议准备一个抑制剂处理过的细胞抽提物作为对照。同时也应以纯化的caspase 作为样本的阳性对照（请参见下列反应混合物配制表）；

4. 将酶标板平衡至37℃或室温，但底物的切割率在37℃较高；

5. 将10ul 的细胞抽提物加入适当孔中（空白对照孔不加）；

6. 将20ul 已知抑制剂（终浓度100nM）或待测抑制剂加入相应孔中；

7. 将酶标板在检测温度预孵育10 分钟，使酶/抑制剂充分反应；

8. 加入10ul 预热至反应温度的pNA 标记底物；

9. 以酶标仪测量405nm 的OD 值，根据需要以1-10 分钟间隔记录反应30-120 分钟内的数据(时间间隔和记录时间长短通常取决于您的caspase 活力以及蛋白含量)。

数据分析

1.针对每个样品，作A405－时间曲线；

2.确定每个样品吸光度值相对时间保持线性关系的时间段，若吸光度值足够大，可计算得准确斜率。底物初始浓度 (200uM) 为饱和浓度。对多数样品来说，底物切割的速率可在2 小时或更长时间内保持稳定，但高活性样品在实验过程中可能导致底物转为亚饱和状态，所以应选择早期曲线线性阶段来计算斜率；

3. 采用相应线性回归程序计算符合线性规律部分的斜率；

4. 计算多个样品斜率平均值；

5. 若空白对照有明显斜率，将此数值从所有样品中扣除；

6.以上数据可对caspase 活性有一个定性了解。若需定量计算样品表达的caspase 活性（按每分钟水解底物的pmol 数）：

7. 确定酶标仪的换算因子：

A．准备50uM pNA-连接的标准品（检测缓冲液），在酶标板的两孔中各加入100ul；

B．以100ul 检测缓冲液作为空白，确定A405 平均值；

C．计算换算因子。此计算基于pNA 校正标准浓度50uM。检测缓冲液中pNA 的消光系数为10000 M^-1 cm^-1 。

D．转换因子 (uM/吸光率)=50uM÷A 405 的平均值；

8.计算活性（每分钟水解底物pmol 数）：活性(pmol/min)=斜率(吸光率/min)×换算因子(uM/ 吸光率)×反应体积(ul)。

二、荧光法检测Caspases 活性

底物工作原理

　　AFC（7-Amino-4-trifluoromethylcoumarin ）为一种荧光分子，以AFC 标记一个合适的caspases 底物（通常为合成肽段），所得到的荧光化合物可用于检测caspases 的活性。底物也可用其他荧光分子进行标记，如AMC（7-Amino-4-methylcoumarin ）。

　　当AFC 标记于底物上时，在适当波长光线激发下（最大激发波长约为400nm）可发出蓝色荧光。Caspases 可对AFC-底物复合物进行切割从而释放出游离的AFC，游离的AFC可发出黄色荧光（最大激发波长约为505nm）。

　　AFC 与其它荧光标记物相比有更大优势，他的黄绿色荧光既是一种可见光（肉眼可见），同时也可荧光计数，且比一般发色底物灵敏度更高。

检测方法原理

　　首先以已知量的游离AFC 或AMC 作出工作曲线（荧光强度）。通过测量荧光强度计算出反应体系中AFC 或AMC 的释放量。AFC 或AMC 的释放量与反应体系中caspases 的活性成正比。Caspases 活性一单位酶量定义为：25℃时，底物浓度为饱和时，每分钟产生1pmol AFC 或AMC 所需的酶量。

样本

　　使用纯化或部分纯化的caspases作为样本，酶量应为15ng左右。若样本未经纯化，应使用特异性caspases 抑制剂处理过的样本作为阴性对照。

荧光方法检测caspases 活性的通用操作步骤

1.制备500uM 的caspase 底物DMSO 储液；

2.制备500uM 的caspase 抑制剂DMSO 储液；

3.制备缓冲液：100mM HEPES，10%蔗糖，10mM DTT，500uM EDTA，以NaOH 或HCl 调pH 值至7.5；

4. 用上一步中配置好的缓冲液以不同稀释度稀释样本；

5. 理论上来说，应对每个浓度的样本都做平行对照如下：

a. 仅含底物的反应体系（空白对照）

b. 样本＋抑制剂＋底物（阴性对照）

c. 样本＋底物

6.通过测量已知量AFC 或AMC 的荧光强度做标准曲线；

7.在加入底物前，首先加入抑制剂与样本进行反应。提前加入抑制剂反应可使实验得到更好效果。反应体系示例：在一个Eppendorf 管中加入440ul 的caspase 缓冲液（第三步制备），20ul 抑制剂，混匀；加入20ul 样本，轻轻混合；30℃孵育60 分钟-12 小时；

8.在空白对照管中加入480ulcaspase 缓冲液，20ul 底物；

9.在阴性对照管中加入20ul 底物；

10.在样本管中加入460ul caspase 缓冲液，20ul 底物，混匀后再加入20ul 样本；

11.将所有Eppendorf 管置于30℃孵育60 分钟，测量荧光强度（FU at t0）；

12.继续孵育60 分钟，测量荧光强度（FU at t1）；

13.按以下公式计算每个样本的荧光强度的变化（ΔFU）；

14. ΔFU ＝（样本t1 时的FU-空白对照t1 时的FU）－（样本t0 时的FU-空白对照t0 时的FU）；

15.计算得到t1 时的酶活性，如果所得酶活性太低，需延长孵育时间（最高至12 小时）；

16. 选择表现出最高样本读数和最低阴性对照读数的那组稀释样本的活性为最终结果。